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簡要描述:ZFNs動物模型:鋅指核酸酶(ZFNs)動物模型是利用鋅指核酸酶基因編輯技術構建的實驗動物模型。鋅指核酸酶由鋅指蛋白(ZFP)和核酸酶(FokI)融合而成,鋅指蛋白能夠特異性結(jié)合目標DNA序列,而核酸酶則負責切割DNA,從而在特定基因位點上引入雙鏈斷裂,誘導細胞的修復機制,實現(xiàn)基因敲除、敲入或突變。
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ZFNs 是第一代可編程基因編輯工具,通過融合 DNA 結(jié)合域(鋅指蛋白)與 DNA 切割域(FokI 核酸酶)實現(xiàn)靶向編輯:
鋅指蛋白結(jié)構域:
由 30-34 個氨基酸重復單元構成,每個單元通過 第 12、13 位可變殘基(RVDs) 識別特定堿基:
RVD 類型 | 識別堿基 | 特異性 |
---|---|---|
NI | A | 高 |
NG | T | 高 |
HD | C | 高 |
NN | G/A | 中等 |
單個鋅指識別 3 bp,串聯(lián) 3-6 個可靶向 9-18 bp 序列。
FokI 切割域:
需 二聚化 才能激活切割功能 → ZFNs 需成對設計(左臂/右臂),切割位點位于兩臂結(jié)合位點之間(間隔區(qū) 5-7 bp)。
編輯機制:
雙鏈斷裂(DSB)→ 細胞啟動修復路徑:
非同源末端連接(NHEJ) :隨機插入/缺失(Indels),導致基因敲除。
同源定向修復(HDR) :需外源修復模板(如 ssODN),實現(xiàn)點突變或基因插入。
技術突破:shou次實現(xiàn)哺乳動物基因組靶向編輯(2005 年),開啟精準基因編輯時代 。
步驟 | 核心操作 | 創(chuàng)新優(yōu)化 |
---|---|---|
靶點設計 | 避開高重復/甲基化區(qū)域,間隔區(qū) 5-7 bp | 軟件預測(ZiFiT)提升結(jié)合效率 |
鋅指組裝 | 模塊化串聯(lián)法: |
3-6 個鋅指單元串聯(lián)
Golden Gate 克?。˙saI/BsmBI) | 6 天完成構建,成功率 >80% |
| 表達載體 | 雙啟動子載體(CMV/T7),支持 mRNA 合成與蛋白表達 | 適配多物種(斑馬魚、小鼠、豬) |
| 遞送方式 | - 受精卵顯微注射 ZFNs mRNA
體細胞轉(zhuǎn)染 + 核移植(大型動物) | mRNA 遞送減少脫靶 |
| 修復增強 | 聯(lián)合 ssODN 模板 + NHEJ 抑制劑(SCR7) | HDR 效率提升 3 倍 |
物種 | 靶基因 | 疾病模型 | 效率/表型 | 研究價值 |
---|---|---|---|---|
斑馬魚 | golden | 白化病 | 95% F0 代色素缺失 | 發(fā)育基因功能篩選 |
小鼠 | Rag2/IL2rg | 免疫缺陷模型 | 雙基因敲除,人源化移植平臺 | 腫瘤免yi治療研究 |
豬 | GGTA1 | 異種器guan移植模型 | 敲除 α-Gal 抗原,降低超急性排斥 | 人源化器官開發(fā) |
果蠅 | yellow | 體色突變 | 生殖系突變率 5.7%(動物模型) | 基因功能保守性驗證 |
高 GC 區(qū)域編輯:
無 PAM 序列限制,可靶向 CRISPR/Cas9 無法編輯的區(qū)域 。
低脫靶率需求:
治療性編輯中脫靶率 <0.1%(CRISPR 為 1-10%)。
大型動物模型:
豬、牛等物種中免疫原性低于 CRISPR 。
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