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ES打靶技術(shù)服務(wù)

簡(jiǎn)要描述:ES打靶技術(shù)服務(wù)(Embryonic Stem Cell Targeting)是一種基于胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的基因靶向技術(shù),主要用于構(gòu)建基因敲除或基因敲入動(dòng)物模型。通過(guò)將外源DNA導(dǎo)入ES細(xì)胞,利用同源重組原理,將目標(biāo)基因進(jìn)行替換或插入,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精準(zhǔn)修飾。

  • 更新時(shí)間:2025-07-09
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詳細(xì)介紹

一、技術(shù)定義與核心原理

ES打靶技術(shù)是一種基于胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ES)同源重組的基因編輯方法,通過(guò)將外源DNA定點(diǎn)整合至基因組特定位置,實(shí)現(xiàn)基因敲除(KO)、條件性敲除(CKO)、基因敲入(KI)及點(diǎn)突變(PM)等精準(zhǔn)修飾。其核心原理包括:

  1. 同源重組機(jī)制

    • 設(shè)計(jì)包含同源臂(與靶基因同源)的載體,通過(guò)同源重組將外源序列(如篩選標(biāo)記基因)插入目標(biāo)位點(diǎn)。

  2. 正負(fù)篩選系統(tǒng)

    • 正篩選標(biāo)記(如Neo?):插入同源區(qū),篩選成功重組的ES細(xì)胞。

    • 負(fù)篩選標(biāo)記(如HSV-tk/DTA):位于同源臂外側(cè),淘汰隨機(jī)插入的細(xì)胞。

  3. 胚胎干細(xì)胞全能性

    • 修飾后的ES細(xì)胞注入囊胚,發(fā)育為嵌合體小鼠(F0),通過(guò)生殖系傳遞獲得穩(wěn)定遺傳模型。

技術(shù)定位:ES打靶是CRISPR前時(shí)代的金標(biāo)準(zhǔn),尤其適用于大片段編輯(>10 kb)和復(fù)雜基因修飾(如條件性敲除)。


二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與技術(shù)創(chuàng)新

(一)傳統(tǒng)ES打靶流程(7-12個(gè)月)

關(guān)鍵步驟解析

  1. 載體構(gòu)建

    • 同源臂長(zhǎng)度通常為3-5 kb,大片段插入需BAC載體。

  2. ES細(xì)胞系選擇

    • 常用品系:129S6/SvEvTac(高重組效率)、C57BL/6N(背景純凈)。

  3. 嵌合體制備

    • 囊胚注射后嵌合率約20-70%,需通過(guò)毛色標(biāo)記(如白化宿主)直觀篩選。

(二)技術(shù)革新:EPS細(xì)胞打靶

EPS細(xì)胞(Extended Pluripotent Stem Cells)由我國(guó)科學(xué)家于2017年shou次報(bào)道,其優(yōu)勢(shì)包括:

  1. 效率提升

    • 打靶效率達(dá)傳統(tǒng)ES細(xì)胞的10-100倍

  2. 周期縮短

    • 嵌合體一步獲得,省去3個(gè)月種系傳遞。

  3. 全能性增強(qiáng)

    • 單細(xì)胞注入囊胚即可生成100%嵌合體。


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