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簡(jiǎn)要描述:ES打靶技術(shù)服務(wù)(Embryonic Stem Cell Targeting)是一種基于胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的基因靶向技術(shù),主要用于構(gòu)建基因敲除或基因敲入動(dòng)物模型。通過(guò)將外源DNA導(dǎo)入ES細(xì)胞,利用同源重組原理,將目標(biāo)基因進(jìn)行替換或插入,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精準(zhǔn)修飾。
詳細(xì)介紹
ES打靶技術(shù)是一種基于胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ES)同源重組的基因編輯方法,通過(guò)將外源DNA定點(diǎn)整合至基因組特定位置,實(shí)現(xiàn)基因敲除(KO)、條件性敲除(CKO)、基因敲入(KI)及點(diǎn)突變(PM)等精準(zhǔn)修飾。其核心原理包括:
同源重組機(jī)制:
設(shè)計(jì)包含同源臂(與靶基因同源)的載體,通過(guò)同源重組將外源序列(如篩選標(biāo)記基因)插入目標(biāo)位點(diǎn)。
正負(fù)篩選系統(tǒng):
正篩選標(biāo)記(如Neo?):插入同源區(qū),篩選成功重組的ES細(xì)胞。
負(fù)篩選標(biāo)記(如HSV-tk/DTA):位于同源臂外側(cè),淘汰隨機(jī)插入的細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞全能性:
修飾后的ES細(xì)胞注入囊胚,發(fā)育為嵌合體小鼠(F0),通過(guò)生殖系傳遞獲得穩(wěn)定遺傳模型。
技術(shù)定位:ES打靶是CRISPR前時(shí)代的金標(biāo)準(zhǔn),尤其適用于大片段編輯(>10 kb)和復(fù)雜基因修飾(如條件性敲除)。
關(guān)鍵步驟解析:
載體構(gòu)建:
同源臂長(zhǎng)度通常為3-5 kb,大片段插入需BAC載體。
ES細(xì)胞系選擇:
常用品系:129S6/SvEvTac(高重組效率)、C57BL/6N(背景純凈)。
嵌合體制備:
囊胚注射后嵌合率約20-70%,需通過(guò)毛色標(biāo)記(如白化宿主)直觀篩選。
EPS細(xì)胞(Extended Pluripotent Stem Cells)由我國(guó)科學(xué)家于2017年shou次報(bào)道,其優(yōu)勢(shì)包括:
效率提升:
打靶效率達(dá)傳統(tǒng)ES細(xì)胞的10-100倍。
周期縮短:
嵌合體一步獲得,省去3個(gè)月種系傳遞。
全能性增強(qiáng):
單細(xì)胞注入囊胚即可生成100%嵌合體。
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