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簡要描述:TALENs動物模型構(gòu)建是利用TALENs基因編輯技術(shù)構(gòu)建的實驗動物模型。TALENs通過融合轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物(TALE)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與核酸酶(FokI)的切割結(jié)構(gòu)域,能夠特異性識別并切割目標DNA序列,從而實現(xiàn)基因組的精準編輯。
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TALENs(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)是一種人工工程化核酸酶,由兩部分構(gòu)成:
DNA識別域(TALE蛋白):
由 34個氨基酸的重復單元 組成,每個單元通過 第12、13位的可變氨基酸(RVDs) 特異性識別單個堿基:
RVD類型 | 識別堿基 | 結(jié)合強度 |
---|---|---|
NI | A | 高特異性 |
NG | T | 高特異性 |
HD | C | 高特異性 |
NN | G/A | 交叉識別 |
識別序列長度通常為 15-20 bp,確保靶向wei一性。
DNA切割域(FokI核酸酶):
需形成二聚體才能切割DNA,因此TALENs需成對設(shè)計(左右臂),切割位點位于兩臂之間(間隔區(qū)通常為12-20 bp)。
雙鏈斷裂(DSB):
TALE結(jié)合靶序列 → FokI二聚化 → 切割DNA雙鏈。
修復路徑:
非同源末端連接(NHEJ) :隨機插入/缺失(Indels),導致基因敲除。
同源定向修復(HDR) :需提供外源修復模板,實現(xiàn)精準插入或點突變。
技術(shù)突破:shu次實現(xiàn)任意基因組位點的精準切割,且脫靶率低于早期ZFN技術(shù)。
步驟 | 核心操作 | 創(chuàng)新方案 |
---|---|---|
靶點設(shè)計 | 避開重復序列/甲基化區(qū)域,間隔區(qū)優(yōu)化為14-18 bp | 軟件預測(TALEN Targeter)提升成功率 |
模塊組裝 | Golden Gate克隆法: |
6模塊串聯(lián)(+63架構(gòu))
酶切連接(BsaI/BsmBI) | 6天內(nèi)完成構(gòu)建,效率提升5倍 |
| 表達載體 | 哺乳動物雙啟動子載體(CMV/T7),支持細胞轉(zhuǎn)染與mRNA合成 | 適配多物種應用(斑馬魚、小鼠、人iPS細胞) |
| 活性驗證 | 酵母單雜交系統(tǒng)或細胞報告基因檢測 | 替代耗時ES細胞打靶,周期縮短至1周 |
| 胚胎遞送 | 受精卵顯微注射:
mRNA:TALENs體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
RNP復合物:TALE-FokI蛋白復合體 | RNP減少脫靶效應,提升安全性
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