當(dāng)前位置:首頁(yè) > 產(chǎn)品中心 > 實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù) > 動(dòng)物模型構(gòu)建 > CRISPR/Cas9動(dòng)物模型構(gòu)建
簡(jiǎn)要描述:CRISPR/Cas9動(dòng)物模型構(gòu)建是一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。該技術(shù)通過向?qū)NA(gRNA)引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向特定基因位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因敲除、敲入或突變,從而在動(dòng)物體內(nèi)模擬人類疾病相關(guān)基因的變異或功能改變。
詳細(xì)介紹
CRISPR/Cas9系統(tǒng)源于細(xì)菌適應(yīng)性免疫機(jī)制,通過雙RNA引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶向DNA切割:
引導(dǎo)機(jī)制:
crRNA(CRISPR RNA)識(shí)別靶序列,tracrRNA(反式激活crRNA)激活Cas9酶,兩者可融合為sgRNA(單鏈引導(dǎo)RNA)。
PAM序列(5'-NGG-3')是Cas9切割的必要位點(diǎn),位于靶基因下游。
切割模式:
Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)鏈,RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈,形成雙鏈斷裂(DSB)。
修復(fù)路徑:
非同源末端連接(NHEJ) :易產(chǎn)生插入/缺失突變(Indels),導(dǎo)致基因敲除。
同源定向修復(fù)(HDR) :需提供同源修復(fù)模板(ssODN或載體),實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)插入或點(diǎn)突變。
革命性突破:CRISPR/Cas9shou次實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效、可編程基因編輯,且支持多靶點(diǎn)同步編輯。
步驟 | 關(guān)鍵操作 | 優(yōu)化方案 |
---|---|---|
sgRNA設(shè)計(jì) | 靶向基因外顯子區(qū),避開脫靶位點(diǎn)(工具:CRISPRscan) | 添加5'端G增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率 |
編輯組件遞送 | - mRNA注射:Cas9 mRNA + sgRNA(小鼠受精卵) - 蛋白注射:Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP) | RNP減少脫靶效應(yīng) |
同源重組增強(qiáng) | 聯(lián)合注射ssODN(單鏈寡核苷酸)及重組增效劑(如RS-1) | RS-1提升HDR效率3-5倍 |
胚胎移植 | C57BL/6品系受精卵 → 假孕母鼠(ICR或BALB/c) | 移植存活率>60% |
模型類型 | 構(gòu)建方法 | 周期 | 效率 | 案例 |
---|---|---|---|---|
基因敲除(KO) | NHEJ修復(fù)誘導(dǎo)移碼突變 | 3-4個(gè)月 | 80% F0代突變 | 免疫缺陷鼠(Rag2/IL2rg雙敲) |
點(diǎn)突變模型 | HDR修復(fù)+ssODN模板 | 4-6個(gè)月 | 20-40% | 阿爾茨海默?。╰au-V337M) |
條件性敲除 | 雙sgRNA靶向flox區(qū)域 + Cre小鼠雜交 | 6-8個(gè)月 | 50% F1代重組 | 肺癌模型(LoxP-Kras/p53) |
大片段敲入 | BAC載體同源重組 + CRISPR切割 | >8個(gè)月 | 10-15% | 人類疾病基因人源化模型 |
肝癌:
同步靶向肝細(xì)胞抑癌基因 PTEN 和 P53,8周內(nèi)誘發(fā)肝癌。
腦瘤:
多基因編輯(Ptch1/Trp53/Pten/Nf1)構(gòu)建成神經(jīng)管細(xì)胞瘤模型。
肺癌:
組織特異性模型:條件性Cas9小鼠 + AAV9遞送sgRNA(靶向Kras/p53/Lkb1),實(shí)現(xiàn)肺組織特異性致癌。
疾病 | 靶基因 | 表型特征 | 研究?jī)r(jià)值 |
---|---|---|---|
白化病 | 酪an酸酶(Tyr) | 毛發(fā)/視網(wǎng)膜色素缺失 | 基因治療載體驗(yàn)證 |
威爾遜病 | ATP7B | 銅代謝障礙→肝損傷 | 基因修復(fù)療法測(cè)試 |
血友病乙 | F9(凝xue因子Ⅸ) | 出血傾向 | 體內(nèi)基因編輯療效評(píng)估 |
阿爾茨海默病:
MAPT突變模型:CRISPR/Cas9編輯小鼠tau蛋白基因,模擬神經(jīng)纖維纏結(jié)。
糖尿病:
db/db小鼠改良:CRISPR精準(zhǔn)引入Lepr突變,縮短模型構(gòu)建周期至12周。
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