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CRISPR/Cas9動(dòng)物模型構(gòu)建

簡(jiǎn)要描述:CRISPR/Cas9動(dòng)物模型構(gòu)建是一種基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。該技術(shù)通過向?qū)NA(gRNA)引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向特定基因位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因敲除、敲入或突變,從而在動(dòng)物體內(nèi)模擬人類疾病相關(guān)基因的變異或功能改變。

  • 更新時(shí)間:2025-07-09
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詳細(xì)介紹

一、技術(shù)原理與核心突破

CRISPR/Cas9系統(tǒng)源于細(xì)菌適應(yīng)性免疫機(jī)制,通過雙RNA引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶向DNA切割:

  1. 引導(dǎo)機(jī)制

    • crRNA(CRISPR RNA)識(shí)別靶序列,tracrRNA(反式激活crRNA)激活Cas9酶,兩者可融合為sgRNA(單鏈引導(dǎo)RNA)。

    • PAM序列(5'-NGG-3')是Cas9切割的必要位點(diǎn),位于靶基因下游。

  2. 切割模式

    • Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)鏈,RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈,形成雙鏈斷裂(DSB)。

  3. 修復(fù)路徑

    • 非同源末端連接(NHEJ) :易產(chǎn)生插入/缺失突變(Indels),導(dǎo)致基因敲除。

    • 同源定向修復(fù)(HDR) :需提供同源修復(fù)模板(ssODN或載體),實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)插入或點(diǎn)突變。

革命性突破:CRISPR/Cas9shou次實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效、可編程基因編輯,且支持多靶點(diǎn)同步編輯。


二、動(dòng)物模型構(gòu)建策略與技術(shù)優(yōu)化

(一)核心操作流程

(二)關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)

步驟關(guān)鍵操作優(yōu)化方案
sgRNA設(shè)計(jì)靶向基因外顯子區(qū),避開脫靶位點(diǎn)(工具:CRISPRscan)添加5'端G增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率
編輯組件遞送- mRNA注射:Cas9 mRNA + sgRNA(小鼠受精卵)
- 蛋白注射:Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)
RNP減少脫靶效應(yīng)
同源重組增強(qiáng)聯(lián)合注射ssODN(單鏈寡核苷酸)及重組增效劑(如RS-1)RS-1提升HDR效率3-5倍
胚胎移植C57BL/6品系受精卵 → 假孕母鼠(ICR或BALB/c)移植存活率>60%

 

(三)模型類型與構(gòu)建效率

模型類型構(gòu)建方法周期效率案例
基因敲除(KO)NHEJ修復(fù)誘導(dǎo)移碼突變3-4個(gè)月80% F0代突變免疫缺陷鼠(Rag2/IL2rg雙敲)
點(diǎn)突變模型HDR修復(fù)+ssODN模板4-6個(gè)月20-40%阿爾茨海默?。╰au-V337M)
條件性敲除雙sgRNA靶向flox區(qū)域 + Cre小鼠雜交6-8個(gè)月50% F1代重組肺癌模型(LoxP-Kras/p53)
大片段敲入BAC載體同源重組 + CRISPR切割>8個(gè)月10-15%人類疾病基因人源化模型

三、疾病模型應(yīng)用與前沿案例

(一)腫瘤模型

  1. 肝癌

    • 同步靶向肝細(xì)胞抑癌基因 PTEN 和 P53,8周內(nèi)誘發(fā)肝癌。

  2. 腦瘤

    • 多基因編輯(Ptch1/Trp53/Pten/Nf1)構(gòu)建成神經(jīng)管細(xì)胞瘤模型。

  3. 肺癌

    • 組織特異性模型:條件性Cas9小鼠 + AAV9遞送sgRNA(靶向Kras/p53/Lkb1),實(shí)現(xiàn)肺組織特異性致癌。

(二)遺傳病模型

疾病靶基因表型特征研究?jī)r(jià)值
白化病酪an酸酶(Tyr毛發(fā)/視網(wǎng)膜色素缺失基因治療載體驗(yàn)證
威爾遜病ATP7B銅代謝障礙→肝損傷基因修復(fù)療法測(cè)試
血友病乙F9(凝xue因子Ⅸ)出血傾向體內(nèi)基因編輯療效評(píng)估

(三)神經(jīng)與代謝疾病

  • 阿爾茨海默病

    • MAPT突變模型:CRISPR/Cas9編輯小鼠tau蛋白基因,模擬神經(jīng)纖維纏結(jié)。

  • 糖尿病

    • db/db小鼠改良:CRISPR精準(zhǔn)引入Lepr突變,縮短模型構(gòu)建周期至12周。


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