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基因編輯陽性細(xì)胞篩選

簡(jiǎn)要描述:基因編輯陽性細(xì)胞篩選是指在基因編輯實(shí)驗(yàn)(如CRISPR/Cas9)后,通過特定方法識(shí)別和分離出成功發(fā)生目標(biāo)基因修飾的細(xì)胞。常用的篩選方法包括抗生素篩選(如利用抗性基因標(biāo)記)、熒光蛋白標(biāo)記篩選、PCR或測(cè)序驗(yàn)證等。這一過程對(duì)于獲得純合或雜合突變細(xì)胞系、研究基因功能或進(jìn)行疾病模型構(gòu)建至關(guān)重要。

  • 更新時(shí)間:2025-07-10
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詳細(xì)介紹

基因編輯陽性細(xì)胞篩選:技術(shù)策略與優(yōu)化流程

陽性細(xì)胞篩選是基因編輯的核心環(huán)節(jié),其效率直接影響實(shí)驗(yàn)周期與成功率。


一、篩選目標(biāo)與挑戰(zhàn)

  1. 核心目標(biāo)

    • 從混合細(xì)胞群中分離成功編輯的細(xì)胞(如基因敲除/KO、敲入/KI)。

    • 排除野生型細(xì)胞干擾(未編輯細(xì)胞占比高時(shí),易導(dǎo)致假陰性)。

  2. 關(guān)鍵挑戰(zhàn)

    • 細(xì)胞損傷:長(zhǎng)期篩選導(dǎo)致細(xì)胞老化(豬成纖維細(xì)胞傳代后增殖能力驟降)。

    • 假陽性風(fēng)險(xiǎn):部分編輯未wan全破壞基因功能(如移碼突變未致功能喪失)。

    • 通量瓶頸:傳統(tǒng)單克隆培養(yǎng)需22天以上,且陽性率不足20%。


二、主流篩選技術(shù)及操作流程

(一)基于報(bào)告系統(tǒng)的富集技術(shù)

利用修復(fù)機(jī)制觸發(fā)熒光/抗性標(biāo)記表達(dá),實(shí)現(xiàn)可視化和快速分選:

修復(fù)機(jī)制報(bào)告系統(tǒng)設(shè)計(jì)篩選方法優(yōu)勢(shì)案例
NHEJ靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復(fù)表達(dá)FACS分選GFP?細(xì)胞直觀高效,適用于KOCRISPR-DIY載體
HDR同源重組插入抗性基因(如Puro?)抗生素壓力篩選適合KI,成本低碧云天CRISPR質(zhì)粒
SSA斷裂誘導(dǎo)單鏈退火修復(fù)→熒光蛋白重構(gòu)流式細(xì)胞術(shù)靈敏度高,脫靶率低多重基因編輯驗(yàn)證

操作流程(以NHEJ-GFP系統(tǒng)為例):

  1. 構(gòu)建含GFP-TAA終止子的編輯載體(sgRNA靶向TAA區(qū)域)。

  2. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,NHEJ修復(fù)破壞終止子→GFP表達(dá)。

  3. 72h后使用流式細(xì)胞儀(如iQue®)分選GFP?細(xì)胞

(二)微量細(xì)胞快速鑒定法

突破性方案:僅需50個(gè)細(xì)胞即可完成基因型鑒定,縮短周期15天以上。

關(guān)鍵參數(shù)

  • 細(xì)胞量:≥50個(gè)(20細(xì)胞組檢出率不足,P<0.01)。

  • 酶切靈敏度:T7E1可檢測(cè)≥5%的編輯效率。

  • 驗(yàn)證步驟:Sanger測(cè)序確認(rèn)突變類型(如插入/缺失)。

(三)酶切與測(cè)序驗(yàn)證技術(shù)
方法原理適用場(chǎng)景局限
T7E1酶切錯(cuò)配切割產(chǎn)生異源雙鏈初篩(低成本)靈敏度低(≥5%編輯率)
Sanger測(cè)序直接讀取序列變異單克隆驗(yàn)證通量低
高通量測(cè)序深度覆蓋靶位點(diǎn)突變多基因/脫靶分析成本高

操作優(yōu)化

  • 混合克隆預(yù)篩:FA-PCR檢測(cè)群體編輯率,>30%時(shí)再分選單克隆。

     
  • 雙驗(yàn)證策略:T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測(cè)序確認(rèn)(避免假陽性)。


三、技術(shù)選擇與場(chǎng)景適配

(一)按細(xì)胞類型選擇
細(xì)胞類型推薦方法理由
原代細(xì)胞微量細(xì)胞鑒定法避免長(zhǎng)期培養(yǎng)致老化(豬成纖維細(xì)胞)
腫瘤細(xì)胞系抗生素篩選 + FACS增殖快,耐藥性穩(wěn)定
iPSCsHDR報(bào)告系統(tǒng) + 單克隆測(cè)序維持多能性,需高精度編輯
(二)按編輯類型選擇
編輯類型篩選技術(shù)關(guān)鍵指標(biāo)
基因敲除(KO)NHEJ-GFP報(bào)告系統(tǒng)GFP?細(xì)胞占比(流式定量)
基因敲入(KI)抗生素篩選 + PCR驗(yàn)證抗性存活率 + 側(cè)翼序列擴(kuò)增
點(diǎn)突變(PM)T7E1 + 深度測(cè)序突變頻率>90%


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